Оценка токсичности спиртов и водок

ЭКСПРЕСС-МЕТОД ОЦЕНКИ ТОКСИЧНОСТИ СПИРТОВ И ВОДОК С
ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЛЮМИНЕСЦЕНТЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

"УТВЕРЖДАЮ"
Заместитель главного государственного санитарного врача Российской Федерации
Е. Н. Беляев
28 мая 2001г.
МР№ФЦ/1859

Методические рекомендации

Метод предназначен для экспресс-оценки безопасности спиртов и водок, изготовленных без добавок биологически активных веществ, крепких алкогольных напитков, на основе ректификованного этилового спирта с использованием в качестве тест-объекта препаратов лиофилизированных бактерий "Эколюм-7" и измерительного прибора серии "Биотокс", в сочетании с другими методами, предусмотренными ГОСТом Р 51698-2000 "Водка и спирт этиловый. Газохроматографический экспресс-метод определения содержания токсичных микропримесей".

Качество алкогольных напитков оценивается по степени интегральной токсичности образца.

Тест-система реагирует на токсические соединения разнообразной химической природы, а также на смеси веществ.

2. Термины и определения

Санитарно-гигиенический государственный контроль осуществляется с целью регулярного слежения за соблюдением нормативов качества окружающей среды и предупреждения попадания токсических веществ в различные объекты и в т. ч. - пищевые продукты.

Химическое загрязнение пищевых продуктов - изменение химического состава пищевых продуктов и напитков, вызывающее снижение их качества и, вследствие этого, возможную опасность для здоровья населения.

Токсичность - степень проявления вредного действия разнообразных химических соединений и их смесей. Токсичность - один из важных факторов, определяющих качество пищевого продукта, достаточно информативный, существенно дополняющий наше представление о степени опасности или безопасности при его использовании, являющийся необходимой составной частью комплексной системы контроля при стандартном анализе.

Критерий токсичности (индекс токсичности) - достоверное количественное значение тест-параметра, на основании которого делается вывод о токсичности продукта. Среди тест-параметров наиболее часто используют выживаемость, плодовитость, подавление ферментативной и метаболической активности организмов.

Тест-реакция - это изменение какого-либо биохимического, морфологического, поведенческого или функционального показателя у тест-объекта под воздействием токсиканта или их смесей.

Биотестирование - проведение анализов по определению токсичности с помощью живых организмов. Результаты оперативно сигнализируют об опасном воздействии химического загрязнения на жизнедеятельность организмов, причем не по отдельным компонентам, а по их смесям, часто неизвестной природы и не выявляемых другими методами анализа токсических веществ.

Токсические эффекты, регистрируемые методами биотестирования, включают комплексный, синергический, антагонистический и дополнительные воздействия всех химических, физических и биологических компонентов, присутствующих в исследуемом образце, неблагоприятно влияющие на физиологические, биохимические и генетические функции тест-организмов.

Биолюминесценция - интенсивное свечение в видимой области спектра, отражающее специфическую ферментативную функцию и общую метаболическую активность организмов.

3. Принцип метода

Метод определения токсичности основан на том, что тест-объект (люминесцентные бактерии) при действии токсических соединений изменяет свои физиолого-биохимические функции, в т. ч. активность фермента бактериальной люциферазы, ответственного за интенсивность биолюминесценции, и реагирует на действие различных химических и биологических факторов аналогично высшим животным. Оценка токсичности основана на определении величины изменения интенсивности биолюминесценции бактерий при действии токсических соединений, содержащихся в тестируемой пробе, по сравнению с контролем - бактерии, содержащие раствор эталонного спирта.

Метод определения интегральной токсичности на основе люминесцентных бактерий неоднократно сравнивался с действием различных токсических веществ на высшие организмы и получены высокие корреляционные зависимости.

Критерием токсического действия является изменение интенсивности биолюминесценции тест-объекта в исследуемой пробе по сравнению с таковой для пробы с раствором эталонного спирта. Уменьшение интенсивности биолюминесценции пропорционально токсическому эффекту.

Острое токсическое действие исследуемого образца на бактерии определяется по ингибированию их биолюминесценции за 15-ти минутный (в экспрессном варианте - 5 мин) период экспозиции. Количественная оценка параметра тест-реакции выражается в виде безразмерной величины - индекса токсичности "Т", равной отношению Т = 100 • (1о - 1)Ло, где 1о и I, соответственно, интенсивность свечения контроля и опыта при фиксированном времени экспозиции исследуемого раствора с тест-объектом. Методика допускает два пороговых уровня индекса токсичности:

  1. допустимая степень токсичности образца: индекс токсичности Т меньше 20;
  2. образец токсичен: индекс Т равен или больше 20.

4. Характеристики погрешности

Метрологические характеристики биотеста в соответствии с аттестацией 4/7-93, проведенной органами Госстандарта: сходимость результатов определения тест-параметра - 5 %, воспроизводимость результатов определения тест-параметра - 5 %.

5. Характсристика тест-объекта "Эколюм" и прибора "Биотокс"

Биосенсор "Эколюм-7" представляет собой лиофилизированные культуры люминесцентных бактерий, содержащиеся в среде инертных газов в специальных стеклянных флаконах. Производится согласно ТУ 6- 09-20-236-93. Биосенсор, содержащийся при температуре 2- 4 °С, имеет гарантированный срок хранения не менее 6 мес.

Специализированный люминометр "Биотокс-10" является измерительным прибором, предназначенным для проведения токсиколого-гигиенического мониторинга объектов окружающей среды, с использованием микробных биолюминесцентных сенсоров серии "Эколюм". Сочетание биохимического датчика с современной электронной аппаратурой позволяет обнаруживать с высокой достоверностью чрезвычайно малые количества токсических соединений и их смесей. В приборе используется простая и надежная технология отбора и предъявления проб, которая безопасна при проведении экологической экспертизы, как в лабораторных, так и полевых условиях.

Портативный прибор "Биотокс-10" может осуществлять следующие функции в автоматическом режиме: определение интенсивности биолюминесценции тест-объекта, индекса токсичности пробы, усредненной величины индекса токсичности, вычисление стандартного отклонения

показателя токсичности, определения величин ЕС20 и ЕС50 - пороговых значений допустимой степени и острой степени токсичности образца, исследование динамики процесса взаимодействия токсикантов с тест-объектом, компьютерная обработка данных, наличие сигнала для оператора при превышения пробой допустимого уровня токсичности.

6. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы

  • · Прибор - люминометр серии "Биотокс", с набором кювет для измерения биолюминесценции, объемом 1,5 мл
  • · Набор для анализа "Эколюм-7", включает в себя:
    - А - флакон с лиофилизированным тест-объектом
    - В - флакон с регидратирующим раствором
    - С - флакон с раствором эталонного спирта
    - D - флакон с раствором эталонного токсиканта
  • · Весы лабораторные общего назначения
  • · рН-метр или аналоги
  • · Термометр лабораторный (0-55 °С), цена деления шкалы - 0,5 °С
  • · Сушильный электрический шкаф
  • · Холодильник бытовой, обеспечивающий замораживание (-18 ± 1 °С) и хранение проб(+ 2 ± 4 °С)
  • · Часы сигнальные
  • · Пипетки автоматические - дозаторы любого типа, объемом 0,02-0,5 мл ± 1,0 %
  • · Цилиндры вместимостью 25, 50 мл, второго класса точности
  • · Стаканы стеклянные лабораторные, вместимостью 10, 50 мл
  • · Пипетки вместимостью 0, 5,1,0 мл
  • · Вода дистиллированная
  • · Натрия гидроокись
  • · Кислота соляная
  • · Кислота серная
  • · Спит этиловый марки "Экстра"
  • · Цинк сернокислый 7-водный
  • · Бумага индикаторная универсальная, для измерения рН
  • · Спиртометр

7. Требования безопасности

7.1. При работе с химическими веществами необходимо соблюдать требования техники безопасности по ГОСТу 12.4.021.

7.2. Рабочие столы и поверхности должны содержаться в чистоте. В конце дня проводится влажная уборка рабочих поверхностей.

7.3. Безопасность при работе с электроустановками обеспечивается по ГОСТу 12.1.019 и в соответствии с требованиями инструкций к оборудованию.

7.4. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТу 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТу 12.4.009.

7.5. Используемые в качестве биотестов лиофилизированные бактерии не патогенны, однако после каждого анализа необходимо стерилизовать всю использованную посуду, остатки растворов в сушильном шкафу при 105 °С в течение 1 ч.

7.6. Хранить тест-культуру "Эколюм" в холодильнике при температуре от - (18 до 2-4) °С, следует беречь культуру лиофилизированных бактерий от нагревания и резкой смены температуры.

8. Требования к квалификации оператора

Определение токсичности по методике выполняется оператором с квалификацией лаборанта со средним специальным образованием.

9. Условия выполнения измерений

Биотестирование проводится в нормальных лабораторных условиях в соответствии с ГОСТом 15150. Помещение не должно содержать токсичных паров и газов.

Температура окружающего воздуха в лаборатории - от 18 до 25 °С. Относительная влажность воздуха - 80 ± 5 %. Атмосферное давление -84-106 кПа (630-800 мм рт.ст.).

При использовании электроприборов частота переменного тока -50 ± 1 Гц. Напряжение сети - 220 ± 10 В.

Освещение помещения естественное или искусственное, не ограничивается особыми требованиями.

10. Подготовка к проведению биотестирования

Предварительная подготовка к отбору проб и выполнению биотестирования должна обеспечивать подготовку посуды, мест хранения отобранных проб, а также подготовку рабочего места для обработки доставленных в лабораторию проб и исследования их на токсичность. Все процедуры предварительной подготовки должны исключить попадание токсичных, органических и каких-либо других веществ в исследуемую пробу.

10.1. Подготовка посуды для отбора, хранения проб и биотестирования

Используется посуда из стекла. Посуда для отбора проб и биотестирования должна быть химически чистой. Она промывается смесью бихромата калия и серной кислоты (хромовой смесью). Стенки посуды осторожно смачиваются хромовой смесью, после чего на 2-3 ч посуда оставляется, затем она тщательно промывается водопроводной водой, нейтрализуется раствором пищевой соды и промывается 3-4 раза дистиллированной водой. Для мытья посуды не разрешается пользоваться синтетическими поверхностно-активными веществами и органическими растворителями. Посуду для отбора проб сушат на воздухе, а используемую для биотестирования, за исключением мерной, - в сушильном шкафу при 105 °С в течение 1 ч.

Химически чистая посуда для биотестирования должна храниться с закрытыми стеклянными притертыми пробками или завинчивающими крышками в защищенных от пыли ящиках лабораторного стола или на закрытых полках, стеллажах и т. п.

10.2. Отбор, хранение и подготовка проб

Отбор проб и их хранение осуществляется в соответствии с руководящими документами, действующими в системе Государственного санитарно-эпидемиологического надзора.

Биотестирование проб проводят не позднее 24 ч после их отбора. Не допускается консервирование проб с помощью химических веществ.

Необходимый для выполнения анализа (в трех и более повторностях) объем проб составляет не более 10 мл.

Температурный оптимум для биотеста составляет 15-25 °С.

10.3. Подготовка тест-объекта "Эколюм" и прибора "Биотокс"

10.3.1. Реконструкция биосенсора

10.3.1.1. Вскрыть флакон "А" с лиофилизированным биореагентом. Добавить из флакона "В" 10 мл охлажденного до 4-8 °С регидратирующего реагента - получают суспензию бактерий. Рекомендуется несколько раз встряхнуть флакон "А" с суспензией бактерий.

10.3.1.2. Выдержать суспензию в холодильнике при температуре + (2-4) °С в течение 30 мин.

10.3.1.3. Довести температуру суспензии бактерий до комнатной температуры (15-25 °С). Рекомендуется перемешивание рабочей суспензии бактерий перед отбором определенных объемов для проведения анализа.

10.3.2. Подготовку прибора "Биотокс" проводят в соответствии с методикой поверки прибора и инструкцией по эксплуатации.

10.3.3. Определение рабочей концентрации биосенсора "Эколюм".

10.3.3.1. Измерить фоновое значение прибора "Биотокс" (по инструкции к прибору, при счете 10 сек без кюветы) и записать это значение.

10.3.3.2. Добавить ОД мл суспензии бактерий из флакона в кювету люминометра. Затем туда же добавить 0,9 мл дистиллированной воды (рН 7,0-7,4) комнатной температуры.

10.3.3.3. Вставить кювету с биореагентом в люминометр и измерить величину интенсивности биолюминесценции за 10 сек. Записать эту величину.

10.3.3.4. Свечение рабочей суспензии бактерий должно находиться в интервале, превышающим фоновое значение прибора в 25-250 раз. Если обнаруженная величина меньше интервала, то увеличить добавку биосенсора (например, добавлять 0,2 мл и т. д.) и повторить измерение. Если величина больше интервала, то следует разбавить суспензию бактерий дистиллированной водой и повторить измерение.

10.3.4. Если у биосенсора истек гарантийный срок хранения и/или он стал плохо растворяться в холодной дистиллированной воде, рекомендуется более энергично его встряхивать и отфильтровать суспензию бактерий через бумажный фильтр.

11. Процедура биотестирования

11.1. Определение токсичности спиртов и водок особых

При определении индекса токсичности необходимо проводить параллельное измерение контрольных и опытных проб. Для большей достоверности данных число повторностей опытной пробы может быть увеличено до 10 измерений. Существует два варианта измерений. Первый вариант - измеряются повторности опытной пробы и прибор автоматически фиксирует значения индекса токсичности каждой пробы, усредненное значение индекса токсичности и погрешности измерения. Второй вариант - измеряются последовательно три (или более) пары контроль-опыт. В каждой паре прибор автоматически фиксирует индекс токсичности и в конце измерения выдает значения усредненного индекса токсичности пробы и значения погрешности измерения. Объем добавляемой суспензии бактерий к пробе должен быть равным в контроле и исследуемой пробе.

11.2. В стандартном анализе отбирают по 0,1 мл рабочей суспензии бактерий и добавляют в три кюветы от люминометра контрольные и три (или более) кюветы для пробы. Добавляют в контрольные кюветы по 0,9мл реагента из флакона "С". Добавляют в остальные кюветы по 0,9 мл опытную пробу с концентрацией этанола 2,5 % и замечают время экспозиции и через определенный интервал измеряют интенсивность биолюминесценции бактерий.

11.3. Измерение интенсивности биолюминесценции проводят с помощью прибора "Биотокс" согласно инструкции по эксплуатации прибора в стандартном варианте через 15 мин экспозиции. В экспрессном варианте допустимо проведение анализа через 5 мин.

12. Работа с прибором "Биотокс"

Подробно принципы работы с "Биотоксом" изложены в техническом описании к прибору.

12.1. Вставить кювету с контролем в кюветный модуль прибора, нажать кнопку "контроль", через 10 сек на индикаторном табло появляется усредненная величина интенсивности биолюминесценции тест-объекта (в относительных единицах).

12.2. Вставить кювету с опытным образцом в кюветный модуль, нажать кнопку "проба", через 10 сек на индикаторном табло появится усредненная величина интенсивности биолюминесценции тест-объекта (в относительных единицах).

12.3. Нажать кнопку "токсичность" - на индикаторном табло появляется значение индекса токсичности (относительная величина).

12.4. Нажать кнопку "сброс" для обнуления прибора.

12.5. Повторить операции 12.1-12.3 определенное количество раз для пар контроль-опыт (для одного измеряемого образца), записать в протокол результаты определения токсичности.

12.6. При использовании одного контрольного образца для серии различных проб измерение контроля проводится один раз, и прибор соотносит автоматически показания проб и контроля с индикацией индекса токсичности каждой пробы.

13. Оценка результатов измерений

13.1. Оценку токсичности пробы проводят по относительному различию в интенсивности биолюминесценции контрольной и опытной проб и вычислению индекса токсичности "Т" (прибор "Биотокс" позволяет автоматически вычислять индекс токсичности). Абсолютная величина интенсивности биолюминесценции контроля не имеет значения в диапазоне допустимых значений прибора "Биотокс".

13.2. Индекс токсичности "Т" есть величина безразмерная, и определяется по формуле Т = 100 • (1о-1)Ло, где 1о и I, соответственно, интенсивность свечения контроля и опыта при фиксированном времени экспозиции исследуемого раствора с тест-объектом. Обработку результатов измерений токсичности выполняют путем расчета среднеарифметического значения величины индекса токсичности "Т" по формуле Т = Т1 + Т2 + Тз)/3, где Т1-Тз - повторности опытной пробы (максимальное число - 10). Величины Т1, Т2 и Тз получают из трех параллельных измерений контроль-опыт в короткий промежуток времени или при измерении в последовательности контроль, и затем серия опытных образцов.

13.3. В ряде случаев возможен вариант, когда интенсивность биолюминесценции в анализируемой пробе больше, чем в контроле. В таком случае независимо от величины отрицательного значения "Т" делается вывод о допустимой степени токсичности образца, и индекс токсичности принимает нулевое значение.

13.4. По величине индекса токсичности анализируемой пробы классифицируются на две группы:

Группы Значение "Т" Вывод о степени токсичности пробы
1 меньше 20 допустимая степень токсичности
2 от 20 и больше образец токсичен

13.5. Методика относительно слабо чувствительна к метанолу, пропанолу и другим примесным к этанолу спиртам. Измерение подобных химических соединений проводится другими методами.

13.6. Результат токсикологического анализа представляется в виде протокола.

14. Контроль погрешности методики токсикологического анализа

14.1. Контроль качества оценки токсичности проводится по определению чувствительности используемых тест-организмов к модельному "эталонному" токсиканту цинку сернокислому 7-водного (ZлS04 • 7Н20), содержащемуся во флаконе "D". Расчет делается на ионы цинка.

Удовлетворительные результаты, полученные при проверке диапазона реагирования люминесцентных бактерий на модельный токсикант, не обеспечивают гарантии адекватного реагирования организмов на другие токсиканты и тем более их смеси, однако регулярно проводимая проверка позволяет выявить ошибки при приготовлении исследуемых смесей и растворов, нарушения, допускаемые в условиях проведения опытов.

14.2. Процедура определения диапазона реагирования тест-системы "Эколюм" на модельный токсикант проводится в соответствии с аттестацией 4/7-93 путем добавления 0,1 мл раствора из флакона "G" к 0,9 мл суспензии бактерий, при времени инкубации 30 мин с биосенсором. Должно происходить не менее, чем 50 %-ное ингибирование интенсивности биолюминесценции по сравнению с контролем. В случае, если эта величина меньше, то следует проверить точность приготовления исследуемых растворов, условий проведения опытов. Если все правильно, то биосенсор не используется.

 

Методика в формате PDF